靶向蛋白质降解（TPD）是一种通过引导E3泛素连接酶接近目标蛋白质，从而促进其泛素化及后续蛋白酶体降解的技术。这种新兴的治疗手段在针对致病蛋白时展现出巨大的潜力。传统上，TPD的实现主要依赖两种方式：第一种是使用蛋白质降解-靶向嵌合体（PROTACs），这种双功能化合物能够分别与靶点和E3连接酶结合；第二种则是通过单价结合的连结酶或靶点的分子胶。

在本文中，我们将着重介绍一种新型的BRD4双功能降解剂——分子内双价粘合剂（Intramolecular Bivalent Glues, IBGs），这种方法为靶向蛋白质降解提供了新的视角。与PROTACs通过trans构象连接目标蛋白和E3连接酶不同，IBGs采用cis构象同时连接目标蛋白的两个相邻结构域，从而增强了与E3连接酶的表面互补性。这种构象的变化充分利用了目标蛋白与连接酶间的天然亲和力，将BRD4“粘”附在E3连接酶DCAF16上，实现BRD4的降解，而没有这种化合物则无法触发降解反应。

通过对BRD4–IBG1–DCAF16三元复合物的结构解析，进一步指导了更高效降解剂的理性设计，使其效力达到低皮摩尔级别。同时，我们利用时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）方法评估了BRD4和DCAF16之间的三元复合物形成。此实验使用了针对BRD4的铕标记抗体和Cy5标记的DCAF16。若IBG分子诱导形成三元复合物，则荧光团间的距离足够近，可以产生荧光共振能量转移（FRET）现象，从而使激发铕供体荧光团的能量转移到Cy5受体荧光团上，这可以通过酶标仪进行测量。

本研究的主要目标是体外表征DCAF16、BRD4与双价分子胶IBG1之间的相互作用。通过等温滴定量热法（ITC）观察到了IBG1、DCAF16与BRD4 Tandem（包含BD1和BD2两个溴结构域并由天然连接肽连接）形成的三元复合物。此外，TR-FRET复合物形成分析显示，IBG1在滴定条件下以剂量依赖的方式促进了BRD4 Tandem与DCAF16之间的复合物形成（EC50=44nM），整体来看，IBG1的活性显著高于其单价前体JQ1。

进一步的TR-FRET稳定性分析也证实，在IBG1存在时，滴定DCAF16至BRD4 Tandem时确实存在复合物形成（Kd=712nM）。令人惊讶的是，即便没有IBG1，DCAF16与BRD4 Tandem间也显示出内在的亲和力（Kd=1μM），但这种亲和力在孤立的BRD4 BD1或BD2结构域中未被观察到，表明二者之间必须协同作用才能形成复合物。

研究还发现，IBG1促使DCAF16与BRD4 Tandem之间的亲和力显著增强（Kd由4μM降低至0.6μM），且相互作用的热力学特性也发生变化。在确认IBG1的作用机制后，研究人员进一步合成了新化合物IBG3，以增强其在BRD4和DCAF16之间的分子胶合活性。新化合物IBG3在降解BRD4方面表现出更加卓越的效果，其降解效率达到低皮摩尔水平（DC50=67pM）。在TR-FRET实验中，IBG3对BRD4–DCAF16复合体的粘合能力得到了显著提升（EC50=32nM）。

综上所述，通过本文所描述的TR-FRET相互作用分析方法，可以有效表征BRD4-DCAF16之间的新型分子胶。这种新型的分子内双价胶通过同时结合目标蛋白的两个结构域，增强了其与E3连接酶的亲和力，同时形成新的相互作用模式。这一策略为靶向多种效应蛋白、重构细胞信号通路、实现蛋白降解及其他医用目的提供了广阔的药理学前景。关注尊龙凯时，获取更多生物医疗创新信息。